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液相色譜柱

液相色譜柱是高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)的核心部件，其性能直接影響到被測(cè)物質(zhì)的分離效果和測(cè)定準(zhǔn)確性。因此，正確安裝、活化、使用和維護(hù)色譜柱對(duì)于確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。本文將為您提供全面的色譜柱使用與維護(hù)建議。
1.使用前的檢查和須知事項(xiàng)
(1) 檢查包裝盒是否完整，盒子側(cè)面有產(chǎn)品信息與自己購買的是否一致。
(2) 打開包裝檢查色譜柱表面有無傷痕，柱兩端是否有塑料堵頭完全封住。
(3) 查看盒內(nèi)是否有檢查報(bào)告及簽名，檢查報(bào)告中有詳細(xì)記錄，填料批號(hào)、貨號(hào)、序列號(hào)及柱性能等參數(shù)。
2.色譜柱的安裝
液相色譜柱通常會(huì)在柱身上標(biāo)明方向，安裝新色譜柱時(shí)，應(yīng)確保連接管路與色譜柱所標(biāo)明的方向一致，避免反沖。另外，連接管路盡量使用合適的細(xì)徑管線，柱的兩端連接端口務(wù)必平整。若接口不匹配，可能會(huì)導(dǎo)致柱效下降、峰形拖尾或滲漏等問題。

一、反相色譜柱（包括C18、C8、苯基）
使用方法：
1. 色譜柱出廠時(shí)都有存儲(chǔ)液，使用時(shí)需用互溶試劑替換。
2. 使用前用潔凈的水與乙腈沖洗系統(tǒng)，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。
3. 將新色譜柱入口端接上系統(tǒng)，出口端先不要連接，在低流速條件下0.2mL/min用純乙腈潤(rùn)洗色譜柱（色譜柱時(shí)間長(zhǎng)的話柱頭兩端儲(chǔ)存液容易干），然后2分鐘后流速升高到0.5，當(dāng)溶劑均勻從柱口端流出，停泵，再將出口端連接到系統(tǒng)檢測(cè)器上（這樣可以避免氣泡進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)，并且可以快速達(dá)到平衡）。備注：如果是色譜柱粒徑是3μm及以下的流速就減半，防止壓力過高。
4. 同樣先低流速開始0.2mL/min 逐步過渡到正常流速，待基線平穩(wěn)后（5-10倍柱體積）換成流動(dòng)相平衡，帶基線平衡后開始進(jìn)樣。
5. 當(dāng)流動(dòng)相有緩沖鹽或離子對(duì)試劑時(shí)需要確保柱內(nèi)有充足的水，再此前用90:10（水：乙腈）充分過渡半小時(shí)以上，再換成流動(dòng)相平衡，待到平衡好后再進(jìn)樣。
保存方法：
● 不含緩沖鹽或離子對(duì)試劑項(xiàng)目：
使用流動(dòng)相沖洗至基線平穩(wěn)，換成乙腈：水=2：8沖洗半小時(shí)（流速1mL/min），再換成乙腈保護(hù)30分鐘，最后色譜柱應(yīng)使用堵頭將兩端密封。
● 含緩沖鹽或離子對(duì)試劑項(xiàng)目：
使用流動(dòng)相沖洗至基線平穩(wěn)，換成乙腈：水=1：9沖洗1小時(shí)（流速1mL/min），再換成乙腈保護(hù)30分鐘，最后色譜柱應(yīng)使用堵頭將兩端密封。注意，緩沖鹽容易析出，再使用前和結(jié)束后需要多用高比例水沖洗。
清洗再生方法：
色譜柱使用一段時(shí)間后容易出現(xiàn)各種問題：
1. 柱壓升高：一般是柱頭篩板污染（固體顆?；驈?qiáng)保留物），可以用溶解污染物的溶劑長(zhǎng)時(shí)間的反向沖洗（低流速0.5mL/min）2小時(shí)以上，或者使用保護(hù)柱套；
2. 緩沖鹽正確使用：緩沖鹽溶于水卻很難溶于有機(jī)試劑，使用后應(yīng)該高比例水沖洗色譜柱；
3. 強(qiáng)保留物滯留色譜柱：其在色譜柱中一段時(shí)間積累后會(huì)產(chǎn)生額外的保留行為，引起峰變寬，拖尾柱效下降等，同時(shí)柱壓也會(huì)不斷升高而使色譜柱損壞。建議用50℃左右甲醇：水=1：3（流速1mL/min）沖洗1小時(shí)之后換成 3：1 再?zèng)_洗1小時(shí)。
注意事項(xiàng)：
進(jìn)行實(shí)際樣品分析的推薦步驟：
1. 確保流動(dòng)相潔凈，每隔24-48小時(shí)就應(yīng)配置流動(dòng)相，并經(jīng)常清洗流動(dòng)相溶劑瓶，以免流動(dòng)相長(zhǎng)菌，確保實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)工作正常；
2. 確保樣品不含顆粒雜質(zhì)，如樣品過臟或有微粒存在就不能直接進(jìn)樣，避免影響色譜柱壽命。一般需要先用濾膜過濾樣品，建議用0.22μm濾膜；
3. 確保樣品與流動(dòng)相條件相兼容，進(jìn)樣后不會(huì)發(fā)生沉淀，通常使用流動(dòng)相或比流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度弱的溶液（有機(jī)比列較低的）溶解或稀釋樣品；
4. 常規(guī)分析過程中，每針間隔若干針清洗柱內(nèi)可能累積的污染物，完成分析后徹底清洗色譜柱，除去緩沖鹽和污染物。

二、氨基柱和硅膠柱
使用方法：
●正相條件下使用：
1. 確保系統(tǒng)內(nèi)不含緩沖鹽，如果有則需要先除去管路中的緩沖鹽；
2. 取下色譜柱，用二通管代替色譜柱連接好管路；
3. 用甲醇或乙腈以2.0mL/min沖洗15min，除去管路中的水；
4. 用異丙醇以2.0mL/min流速?zèng)_洗15min，除去管路中的甲醇或乙腈；
5. 取下二通管，換上色譜柱，用異丙醇以0.5mL/min沖洗色譜柱45min；
6. 換上純正己烷作流動(dòng)相過渡，以1.0mL/min沖洗色譜柱15min；（因?yàn)楫惐嫉臉O性很強(qiáng)，哪怕是少量的異丙醇進(jìn)入到流動(dòng)相中都可能引起保留時(shí)間的顯著變化）；
7. 換上分析流動(dòng)相走基線，通常這個(gè)過程至少需要30min，基線平穩(wěn)后進(jìn)樣。
● 正相體系換成反相體系的方法：
1. 取下正相色譜柱，用二通管代替色譜柱連接管路，用異丙醇以2.0mL/min沖洗15min；
2. 換上純甲醇或乙腈，以2.0mL/min的流速?zèng)_洗10min。
●反相條件下使用：
氨基柱和硅膠柱出廠時(shí)通常保存在正己烷：異丙醇體系中，使用前先用異丙醇（0.2mL/min）過渡1晚，再用乙腈以0.5mL/min的流速?zèng)_洗3小時(shí)，后換成流動(dòng)相沖洗1小時(shí)后待基線平衡后開始做樣。使用氨基柱時(shí)需要注意，由于氨基柱需要過渡飽和，一般前面幾針效果不一定能達(dá)到要求，所以多進(jìn)幾針飽和后就正常了。
保存方法：
●正相使用
1. 因?yàn)槌鰪S時(shí)氨基柱和硅膠柱通常保存在正己烷：異丙醇體系中，所以正相條件下使用時(shí)可以直接用流動(dòng)相跑基線。
2. 由于基質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附性能，為防止強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱中的存留，每天分析任務(wù)完成后，需用異丙醇以0.5mL/min流速?zèng)_洗色譜柱60min，最后保存在異丙醇中；
3. 長(zhǎng)時(shí)間保存最好用異丙醇沖洗色譜柱后，用正己烷封存，然后擰緊兩端的塑料篩頭。
●反相使用
保存方法和反相柱相近，用乙腈沖洗1小時(shí)，如有緩沖鹽用乙腈水和流動(dòng)相比例接近沖洗1小時(shí)后換成乙腈沖洗40分鐘。如短期不用，乙腈保存；長(zhǎng)期不用時(shí)需依次用甲醇、異丙醇置換，最后用正己烷保存。
清洗再生方法：
●正相使用
第一步：異丙醇（5 倍柱體積）
第二步：50%乙腈水溶液（5 倍柱體積）
第三步：含 0.1% EDTA 的水溶液（10 倍柱體積）
第四步：0.2M 醋酸銨水溶液（20 倍柱體積）
第五步：50%乙腈水溶液（5 倍柱體積）
第六步：乙腈（10 倍柱體積，封存）
●反相使用（參照C18柱方法）
1. 柱壓升高：一般是柱頭篩板污染（固體顆?；驈?qiáng)保留物），可以用溶解污染物的溶劑長(zhǎng)時(shí)間的反向沖洗（低流速0.5mL/min）2小時(shí)以上，或者使用保護(hù)柱套。
2. 緩沖鹽正確使用：緩沖鹽溶于水卻很難溶于有機(jī)試劑，使用后應(yīng)該高比例水沖洗色譜柱。
3. 強(qiáng)保留物滯留色譜柱：其在色譜柱中一段時(shí)間積累后會(huì)產(chǎn)生額外的保留行為，引起峰變寬，拖尾柱效下降等，同時(shí)柱壓也會(huì)不斷升高而使色譜柱損壞。建議用50℃左右甲醇：水=1：3（流速1mL/min）沖洗1小時(shí)之后換成 3：1 再?zèng)_洗1小時(shí)。
注意事項(xiàng)：
1、氨基柱和硅膠柱可以用于正相條件，也可以用于反相條件，但需要注意正相溶劑和反相溶劑往往是不互溶的，對(duì)這一點(diǎn)的忽略可能會(huì)帶給使用者一些麻煩，對(duì)于新購買到的柱子，首先請(qǐng)注意打開分析測(cè)試說明書，了解柱子的保存溶劑。如果保存溶劑與將要使用的流動(dòng)相極性不同不互溶就會(huì)造成色譜柱損壞，所以切換正反向流動(dòng)相時(shí)請(qǐng)先用異丙醇過渡。過渡過程中注意因異丙醇粘度較大，會(huì)導(dǎo)致柱壓很高，適當(dāng)調(diào)低流速即可。如果要使用的流動(dòng)相中還含有緩沖鹽類，建議在用分析流動(dòng)相之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動(dòng)相過渡，這樣可避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)的析出。
2、氨基柱和硅膠柱用于正相條件，使用時(shí)需注意如下事項(xiàng)：
⑴ 因?yàn)槌鰪S時(shí)氨基柱保存在正己烷/異丙醇＝99.5/0.5中，所以正相條件下使用時(shí)可以直接用流動(dòng)相跑基線；
⑵ 由于基質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附性能，為防止強(qiáng)保留物質(zhì)在色譜柱中的存留，每天分析任務(wù)完成后，需用異丙醇以0.5mL/min流速?zèng)_洗色譜柱60min，最后保存在異丙醇中；
⑶ 長(zhǎng)時(shí)間保存最好用異丙醇沖洗色譜柱后，用正己烷封存，然后擰緊兩端的塑料篩頭